傳統(tǒng)的熒光顯微技術(shù)在生物成像領(lǐng)域有兩個(gè)難以克服的挑戰(zhàn)：一是對(duì)生物樣品的結(jié)構(gòu)做3D成像。在傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微鏡中，照明光會(huì)照亮光路上的整個(gè)樣品，來(lái)自非焦平面的雜散光信號(hào)也會(huì)被成像物鏡收集到（圖1），干擾所要觀察的樣品信號(hào)，不但降低橫向分辨率，軸向分辨率也只能達(dá)到2.5μm左右，比大多數(shù)生物結(jié)構(gòu)都要大，因此很難對(duì)樣品3D結(jié)構(gòu)清晰而準(zhǔn)確地成像；另一個(gè)挑戰(zhàn)是對(duì)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰成像。在觀察細(xì)胞內(nèi)部活動(dòng)時(shí)，細(xì)胞膜的熒光信號(hào)會(huì)對(duì)成像產(chǎn)生極大的干擾。

圖1 小鼠腎臟切片（厚度20μm）分別在 (a) 寬場(chǎng)和 (b) 熒光共聚焦顯微鏡下的成像效果。哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞（厚度50μm）分別在 (c) 寬場(chǎng)和 (d) 熒光共聚焦顯微鏡的成像效果。Scale bar: 20μm。(Adapted from Jonkman and Brown 2015)

如何排除這些來(lái)自非焦平面的干擾信號(hào)呢？早在1953年，美國(guó)學(xué)者馬文·明斯基就提出了“共聚焦”的構(gòu)想。經(jīng)過(guò)30年的發(fā)展，這一想法逐漸成為今天非常成熟的 共聚焦顯微成像技術(shù)。“共聚焦”的原理就是在樣品的共軛焦平面上添加一個(gè)帶有“針孔”的擋板（圖2），通過(guò)針孔阻斷雜散光，提高分辨率和對(duì)比度。共聚焦顯微鏡具有較好的光學(xué)切片能力，軸向分辨率可提高到500 nm左右。

圖2 共聚焦原理示意：位于共軛平面上的針孔阻擋了來(lái)自樣品上方 (a) 和下方 (b) 的雜散光，只有來(lái)自焦平面的光才能通過(guò)針孔進(jìn)入探測(cè)器（c）。

傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡使用逐點(diǎn)掃描，用光電倍增管（PMT）作為檢測(cè)器，雖然成像清晰，但是速度比較慢。而且PMT的光電轉(zhuǎn)換效率也比較低，需要較強(qiáng)的激發(fā)光。這就導(dǎo)致這種技術(shù)的光漂白和光損傷非常大，極不適用于活細(xì)胞成像。

為了對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行快速成像，我們本期專(zhuān)題的主角——轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡閃亮登場(chǎng)了。

轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡

轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡的原理是在物鏡像平面上放置一個(gè) Nipkow 轉(zhuǎn)盤(pán)，轉(zhuǎn)盤(pán)上分布著排列成阿基米德螺旋的針孔（圖3），激光光源覆蓋所有針孔的范圍（即掃描區(qū)域），每當(dāng)轉(zhuǎn)盤(pán)旋轉(zhuǎn)30°，一個(gè)針孔就掃描圖像上對(duì)應(yīng)的一塊區(qū)域，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的完整掃描。與傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描方式相比，這種多點(diǎn)同步掃描方式不僅大大提高了采集速度，也意味著可以使用面陣相機(jī)（背照式sCMOS或EMCCD）取代PMT，提高量子效率，從而降低激發(fā)光功率，大大降低了對(duì)樣品的光漂白和光損傷。轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦模塊通常是獨(dú)立的，可以加在顯微鏡的相機(jī)端口（圖4）。圖像亮度、對(duì)比度和光學(xué)切片質(zhì)量都可以通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)盤(pán)性能得到改善。

圖4 Yokogawa CSU-X1轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦裝置示意。該裝置包括電動(dòng)旋轉(zhuǎn)針孔盤(pán)和微透鏡盤(pán)，可安裝在顯微鏡的攝像機(jī)端口上。（From Zeiss Campus）

與激光掃描共聚焦相比，轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦具有高速，高靈敏度，易于安裝等優(yōu)點(diǎn)，更適合研究活細(xì)胞及其內(nèi)部動(dòng)態(tài)過(guò)程。

透射率

入射光通過(guò)轉(zhuǎn)盤(pán)的比率稱(chēng)為透射率T，可用如下公式計(jì)算:

D：針孔直徑；S：針孔間隔距離。
針孔直徑?jīng)Q定了穿過(guò)針孔的光的多少——較大的針孔可以讓更多的光通過(guò)；而間隔距離決定了較長(zhǎng)尺度上的阻斷雜散光的能力。離焦平面足夠遠(yuǎn)的雜散光會(huì)進(jìn)入相鄰的針孔，這一過(guò)程稱(chēng)為針孔串?dāng)_（Pinhole cross-talk）。串?dāng)_的程度取決于樣品，樣品越厚影響越大。增加間隔距離可以降低串?dāng)_，但代價(jià)是減少光的通過(guò)率。

當(dāng)我們帶入典型值D=25μm和S=250μm，可以得到透射率僅為1%，說(shuō)明絕大多數(shù)光（主要是雜散光）都可以被阻擋。然而，激發(fā)光強(qiáng)和相機(jī)靈敏度仍然是決定圖像質(zhì)量的關(guān)鍵。

轉(zhuǎn)盤(pán)照明光的透射率可以通過(guò)微透鏡進(jìn)行提高。圖5為 Yokogawa 公司設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)盤(pán)裝置，它由兩個(gè)同軸排列的圓盤(pán)組成，每個(gè)圓盤(pán)包含大約20000個(gè)針孔。上圓盤(pán)在下圓盤(pán)每一個(gè)針孔對(duì)應(yīng)的位置都裝有微透鏡，將入射光直接聚焦在下圓盤(pán)的針孔上，再照射到樣品上。通過(guò)添加微透鏡盤(pán)，可以將透射率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)（Inoue and Inoue 2002），進(jìn)一步降低了激發(fā)光強(qiáng)度。

圖5：微透鏡圓盤(pán)通過(guò)主圓盤(pán)的針孔聚焦照明光。發(fā)射光被分色鏡分離進(jìn)入相機(jī)（Graf, Rietdorf and Zimmermann 2005）。

針孔直徑

針孔直徑是轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦系統(tǒng)的一個(gè)重要參數(shù)。針孔過(guò)大會(huì)降低軸向分辨率。針孔過(guò)小又會(huì)導(dǎo)致照明光過(guò)度衍射和過(guò)度阻擋發(fā)射光，降低圖像對(duì)比度。通常來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)盤(pán)針孔直徑都會(huì)由制造商針對(duì)60倍或100倍油鏡進(jìn)行優(yōu)化。

對(duì)于給定物鏡的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，有三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)決定了*佳針孔直徑（Dopt）：

1. 發(fā)射光波長(zhǎng)λEm

2. 物鏡數(shù)值孔徑NAopt

3. 物鏡放大倍數(shù)Mopt
   

有如下公式：

以GFP為例（λEm=509nm），使用1.4NA，60x油鏡，*佳針孔直徑為26.2μm。對(duì)于1.4NA，100x油鏡，*佳直徑為43.6μm。

分辨率

與常規(guī)熒光顯微鏡一樣，轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡的橫向分辨率由光學(xué)系統(tǒng)決定，不過(guò)成像對(duì)比度增加，因此對(duì)樣品細(xì)節(jié)的分辨能力更好。在選擇相機(jī)時(shí)，需要考慮像元尺寸和系統(tǒng)光學(xué)分辨率之間的匹配。（不會(huì)選擇？快快點(diǎn)擊閱讀分辨率中——作成像的你不得不了解的真相6）

轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡的軸向分辨率通常在800nm左右（使用高NA 物鏡）。根據(jù)奈奎斯特采樣定律，z軸步進(jìn)約為350nm左右。如果需要獲得更清晰，對(duì)比度更好的圖像，就需要進(jìn)行反卷積，我們將在后續(xù)文章中詳細(xì)為大家介紹。

針孔聚焦

使用轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡需要一個(gè)額外的步驟：由于圖像是在Nipkow-Petran轉(zhuǎn)盤(pán)的平面上形成的，因此需要將相機(jī)聚焦到該平面上以采集圖像。當(dāng)相機(jī)未聚焦時(shí)，圖像就會(huì)模糊（圖6）。幸運(yùn)的是，這些針孔為正確的焦平面提供了參考。要將相機(jī)聚焦在針孔平面上，首先必須停止轉(zhuǎn)盤(pán)旋轉(zhuǎn)，然后將調(diào)節(jié)相機(jī)距離直到針孔邊緣清晰，就可以得到清晰的圖像了。

圖6 相機(jī)未聚焦導(dǎo)致的圖像模糊。（1.49NA，100x物鏡）（Stehbens, et al. 2012）

采集速度

從原理上來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡的*大采集速度取決于至少一個(gè)針孔掃描整個(gè)圖像的速度——通常是圓盤(pán)旋轉(zhuǎn)30°所需的時(shí)間。在曝光時(shí)間很短的應(yīng)用中（如高速動(dòng)態(tài)成像），如果曝光時(shí)間小于掃描時(shí)間，則部分樣品不會(huì)被掃描到，就會(huì)出現(xiàn)黑線(xiàn)（圖7，左）。轉(zhuǎn)盤(pán)旋轉(zhuǎn)速度較慢也會(huì)導(dǎo)致不完全掃描，圖像也會(huì)出現(xiàn)條紋（圖7，中）。解決這個(gè)問(wèn)題的方法是使相機(jī)的曝光與轉(zhuǎn)盤(pán)的旋轉(zhuǎn)同步，確保曝光時(shí)間等于掃描時(shí)間的整數(shù)倍。當(dāng)曝光時(shí)間使用比掃描時(shí)間長(zhǎng)得多時(shí)，就可以避免這個(gè)問(wèn)題（圖7，右）

圖7 在較短的曝光時(shí)間或較低的轉(zhuǎn)盤(pán)旋轉(zhuǎn)速度下，相機(jī)曝光和轉(zhuǎn)盤(pán)旋轉(zhuǎn)不同步導(dǎo)致樣本覆蓋不均，成像時(shí)出現(xiàn)條紋。（1.49NA，100x物鏡）Scale bar: 10μm. (Stehbens, et al. 2012)

然而，在實(shí)際的顯微成像設(shè)置中，由于發(fā)射的熒光穿透轉(zhuǎn)盤(pán)的透過(guò)率很低，為了獲得較好的信噪比，曝光時(shí)間一般不會(huì)很短，所以系統(tǒng)的*終成像速度其實(shí)是受限于相機(jī)的曝光時(shí)間。對(duì)于速度較慢的CCD相機(jī)來(lái)說(shuō)，主要是受限于相機(jī)自身的讀出幀速。

轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡克服了傳統(tǒng)熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦的缺點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞3D成像，快速動(dòng)態(tài)成像，長(zhǎng)時(shí)間時(shí)間序列拍攝以及內(nèi)部細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)成像等應(yīng)用。然而，由于它是通過(guò)抑制光通過(guò)來(lái)提高分辨率的，搭建系統(tǒng)時(shí)，要確保相機(jī)能盡可能多地收集光子。因此，在相機(jī)選擇上，高靈敏度是首要標(biāo)準(zhǔn)。EMCCD相機(jī)曾經(jīng)是轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微系統(tǒng)的**選擇，但現(xiàn)在，越來(lái)越多的用戶(hù)正轉(zhuǎn)向背照式sCMOS相機(jī)（如Prime 95B，Prime BSI），它們具有與EMCCD相機(jī)相當(dāng)?shù)撵`敏度，但視野更大，成像速度更快。

在下一期中，我們將繼續(xù)介紹一些不同的轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微系統(tǒng)及其應(yīng)用，請(qǐng)大家繼續(xù)關(guān)注我們的前沿顯微成像技術(shù)專(zhuān)題系列哦~

References

Graf, R, J Rietdorf, and T Zimmermann. 2005. “Live Cell Spinning Disk Microscopy.” Adv Biochem Engin/Biotechnol 95: 57-75.

Inoue, S, and T Inoue. 2002. “Direct-View High-Speed Confocal Scanner: The CSU-10.” Methods Cell Biology 70.

Jonkman, J, and C M Brown. 2015. “Any Way You Slice It - A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.” Journal of Biomolecular Techniques 26: 54-65.

Stehbens, S, H Pemble, L Murrow, and T Wittmann. 2012. “Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.” Nature Methods Enzymology 504: 293-313.